Sintesis Molekul Rekombinan

Sintesis molekul rekombinan (gabungan dari dua sumber DNA berbeda) merupakan tahapan penting dalam teknik kloning gen. Ada dua tahapan dalam konstruksi suatu molekul rekombinan, yaitu tahap pemotongan fragmen DNA target (yang hendak kita perbanyak) dan DNA vektor kloning (misalnya plasmid) dan tahap penyambungan (ligasi) DNA target ke dalam vektor kloning.

Teknik pemotongan fragmen DNA bukan perkara yang mudah. Teknik ini melibatkan kerja dari suatu enzim yang dikenal dengan enzim restriksi endonuklease. Enzim ini memotong secara spesifik fragment DNA dengan urutan basa tertentu. Daerah yang dipotong enzim ini dikenal dengan daerah restriksi. Enzim ini bekerja memutus ikatan fosfodiester dari di antara dua basa dalam fragment DNA. Sebagai contoh enzim restriksi endonuklease EcoRI akan memutus fragmen DNA yang memiliki urutan basa DNA: GAATTC. Enzim ini akan memutus ikatan fosfodiester di antara basa G dan A (lihat gambar).

Biasanya dalam teknik pemotongan terget DNA maupun DNA vektor kloning digunakan dua macam enzim restriksi endonuklease tipe II yang berbeda daerah pemutusannya. Saya pernah menggunakan enzim EcoRI dan BamHI secara bersamaan untuk memotong target DNA dan vektor kloning yang saya pakai. Tahapan pemilihan dua enzim yang berbeda ini menjadi penting agar di dalam tahapan selanjutnya (tahap penyambungan kedua fragmen DNA) tidak terjadi kesalahan (urutan fragmen target DNA terbalik menyambung di DNA vektor kloning).

Sebagai tips, gunakan enzim restriksi yang menghasilkan ujung pemotongan lengket (sticky end) seperti pada enzim EcoRI, bukan ujung tumpul (blunt end). Ujung lengket akan lebih memudahkan kita dalam menyambungankan dua fragmen DNA ini.

Setelah dua enzim terpotong dengan baik, tahap selanjutnya adalah penyambungan dua fragmen DNA yang sudah terpotong dengan bantuan enzim ligase. Enzim ligase bekerja mengkatalisis pembentukkan ikatan fosfodiester di antara ujung 3' hidroksil dan ujung 5' fosfat pada fragmen DNA yang hendak disambungkan. Skema pemotongan sekaligus penyambungan kedua fragmen DNA dilukiskan dalam gambar di bawah ini:

Tahapan Konstruksi Mokelul Rekombinan

Dalam teknik kloning gen, kedua tahapan ini menjadi penting karena menjadi teknik yang sangat menentukan apakah target DNA kita bisa diklon (diperbanyak) atau tidak nantinya. Jika tahap konstruksi molekul rekombinan ini gagal, maka gagal pula tahapan selanjutnya.