Isolasi DNA Kromosom

http://ehrig-privat.de/ueg/images/dna-structure.jpg

Isolasi DNA merupakan metode awal dalam teknik kloning gen. DNA yang mengandung gen target terlebih dahulu diisolasi (diekstraksi) dari sel asal (bisa sel bakteri, tanaman, hewan, atau manusia). Protokol yang ideal  untuk isolasi adalah mudah, murah, dan cocok diaplikasikan untuk sample dalam jumlah kecil.

Isolasi DNA yang paling mudah menggunakan detergen, garam, dan alkohol. Detergen berguna untuk merusak struktur sel, garam dapat terikat pada DNA, dan alkohol (etanol) digunakan untuk mengendapkan DNA, selain untuk membersihkan DNA dari sisa-sisa komponen sel yang lain.

Prinsip Isolasi DNA

• Preparasi sel sumber
• Sel dilisis dengan SDS (sodium dodecyl sulfate), DTT, atau Proteinase K
• Pelisisan membran sel/organel/nukleus menggunakan:
• Fenol : Kuat melisis mebran sel, tetapi toksik
• Guanidine isothiosianate : Tidak toksik, digunakan sebagai pengganti fenol
• Denaturasi senyawa organik dalam sel dengan:
• Kloroform : Prosedur sederhana dan murah
• Proteinase K : Untuk mendenaturasi protein, perlu inkubasi
• Presipitasi (pengendapan) DNA dengan penambahan:
• Isopropanol
• Etanol absolut dan sodium asetat dengan perbandingan 1:1
• Pencucian atau Purifikasi DNA menggunakan:
• Etanol 70%

Isolasi DNA Sel Eukariot Protozoa dengan Metode Chelex (Chelating Ion Exchange) Resin

1. Disiapkan larutan 5-20% Chelex di dalam 1X buffer Tris-EDTA (simpan segera di 4ºC jika tidak digunakan). 
2. Persiapan sample:
• Sample sel ditambahkan 1 ml saponin/PBS 0,5% dingin dan diinkubasi semalam pada 4ºC.
• Sample disentrifugasi 12.000 rpm, 10 menit untuk mendapatkan peletnya.
• Pelet dicuci dengan 1 ml PBS pH 7.2 dan disentrifus lagi pada 4000 rpm, 5 menit (3x).
• Pelet ditambahkan 50 µL dH₂O steril dan 200 µL suspensi Chelex 20%.
• Suspensi diinkubasi dalam penangas air mendidih selama 8 menit dengan sesekali divorteks setiap 3 menit.
• Suspensi disentrifugasi 12.000 rpm selama 10 menit untuk mendapatkan supernatanya.
• Supernatan yang diperoleh dipindahkan ke tabung baru dan disimpan pada -20^oC. DNA hasil isolasi siap digunakan untuk tahap selanjutnya.

Isolasi DNA dari Sel Tanaman dengan Metode CTAB

1. Sterilisasi semua alat yang akan digunakan (mortar, )menggunakan autoklaf suhu 121ºC, tekanan 15 psi, selama 30 menit.
2. Siapkan sample tanaman misalnya daun yang masih muda berusia sekitar 3 minggu.
3. Daun dicacah menggunakan gunting dan dimasukkan dalam mortar.
4. Tambahkan nitrogen cair secukupnya dan gerus daun hingga halus. Lakukan pengulangan beberapa kali sampai daun benar-benar halus.
5. Daun yang sudah halus ditambahkan 500 µL buffer CTAB (kandungannya: CTAB 10 ml, PVP 0,4 g, dan betha merkapto etanol 50 µL).
6. Larutan sample dimasukkan dalam tabung sentrifus mikro steril 1,5 ml.
7. Sample diinkubasi dalam waterbath suhu 65ºC selama 60 menit (setiap 10 menit, sample dibolak-balik agar homogen).
8. Ke dalam sample ditambahkan 500 µL campuran kloroform : isoamil alkohol (24:1). Sample dihomogenkan dengan dibolak-balik selama beberapa kali.
9. Sample disentrifugasi pada 14.000 rpm selama 7 menit.
10. Lapisan paling atas dipindahkan ke tabung mikrosentrifus steril baru. Untuk meminimalisir pengotor pada DNA yang akan disolasi, penambahan campuran kloroform : isoamil alkohol (24:1) bisa dilakukan beberapa kali. 
11. Ke dalam larutan sample ditambahkan amonium asetat dingin sebanyak 0,08 x volume dan isopropanol dingin sebanyak 0,54 x volume. Tahapan ini berguna untuk mengendapkan DNA target.
12. Larutan diinkubasi dalam es selama 30 menit. Tahap ini juga berguna untuk membantu percepatan pengendapan DNA target.
13. Sample disentrifugasi 15 menit pada 14.000 rpm.
14. Supernatan dibuang, sementara pelet DNA yang diperoleh ditambahkan 700 µL alkohol 70%. Sample dibolak-balik beberapa kali agar semua bagian DNA terbilas alkohol.
15. Sample kembali disentrifugasi pada 14.000 rpm selama 1 menit.
16. Supernatan dibuang, pelet yang diperoleh ditambahkan 700 µL alkohol 95%. Sample dibolak-balik beberapa kali. 
17. Sample disentrifugasi selama 1 menit pada 14.000 rpm. Supernatan dibuang, sementara pelet DNA yang diperoleh dikering-anginkan 15 menit. 
18. Setelah kering, pelet DNA disuspensikan dengan penambahan 50 µL buffer TE.
19. DNA siap digunakan untuk analisis selanjutnya seperti kuantitasi DNA dengan spektrofotometer atau disimpan pada -20ºC.

Catatan:

• Isolasi DNA target dari sel tumbuhan lebih sulit karena pada tumbuhan banyak menghasilkan metabolit sekunder yang disimpan di vakuola. Sementara vakuola sendiri ukurannya relatif besar.
• Jika pada tahapan isolasi DNA target, vakuola pecah, maka sudah bisa dipastikan metabolit sekunder dalam vakuola akan menjadi penggangu atau kontaminan.