Vektor Kloning

Membicarakan teknik biologi molekuler (kloning gen), tidak lengkap rasanya jika kita tidak mengulas mengenai vektor kloning. Vektor kloning menjadi penting karena dia berperan sebagai media agar target DNA bisa diperbanyak untuk selanjutnya diekspresi menjadi protein yang diinginkan. Analogi sederhananya adalah ketika kita hendak pergi ke mall yang jaraknya jauh untuk berbelanja, kita tentu memerlukan alat transportasi untuk mencapainya (bisa angkot, motor, mobil pribadi). Seperti alat transportasi inilah peran vektor kloning. Meskipun tidak 100% sama karena alat transportasi akan kita tinggalkan jika kita sudah mencapai mall yang kita tuju, sementara vektor kloning tetap diperlukan, meskipun target DNA kita sudah masuk ke dalam sel organisme inang yang diinginkan.

Ada sangat banyak vektor kloning yang tersedia saat ini, seperti plasmid, cosmid, yeast artificial chromosomes (YACs), bacterial artificial chromosomes (BACs), phage, transposon, dll. Vektor kloning yang kita gunakan setidaknya harus memenuhi beberapa persyaratan:

1. Mengandung replicon yang memungkinkan vektor kloning mereplikasi (mencopy) dirinya sendiri saat di dalam sel inang.
2. Ukurannya cukup kecil dan tidak terdegradasi selama pemurnian
3. Mengandung gen penanda selektif (selectable marker) yang berperan dalam tahap penyeleksian sel inang apakah telah mengandung vektor rekombinan atau tidak. 
4. Memiliki daerah pemutusan yang unik (multi cloning site) sehingga memungkinkan vektor rekombinan dipotong secara enzimatis sehingga target DNA dapat diperoleh kembali. 
5. Beberapa vektor yang diperlukan untuk tahap ekspresi gen menjadi protein harus mengandung sekuen promoter, terminator, dan ribosome binding sites.

Plasmid

Merupakan vektor kloning yang paling banyak digunakan untuk inang sel bakteri. Umumnya berukuran <5 kb, berbentuk DNA sirkular utas ganda, yang biasanya secara alami ada di sel bakteri. Plasmid mengandung kemampuan memperbanyak dirinya sendiri (syaratnya harus berada di dalam sel inang bakteri) dari mulai 1 copy per sel, 10-20 copy per sel sampai 1000 copy per sel. Kemampuan memperbanyak dirinya sendiri ini karena plasmid memiliki titik replikasi (origin of replication). Plasmid juga memiliki multi cloning site (MCS), yaitu daerah yang dikenali enzim restriksi endonuklease, yang memungkinkan plasmid disambung dengan target DNA. 

Disamping memiliki kelebihan, vektor kloning plasmid memiliki beberapa kekurangan, seperti ukuran target DNA yang bisa disisipkan terbatas (sekitar 10 kb), untuk target DNA yang ukurannya besar seringkali sulit ditangani dan mudah terdegradasi, kemampuan untuk masuk ke sel inang bakteri (transformasi) semakin menurun dengan semakin besarnya ukuran plasmid. Gambar di bawah ini adalah salah satu contoh vektor kloning plasmid yang pernah saya gunakan:

Gambar salah satu plasmid yang digunakan dalam teknik kloning (sumber: Promega)

Bersambung....