Isolasi DNA Plasmid dari Sel Bakteri

Setelah sebelumnya kita mempelajari teknik isolasi DNA kromosom, kali ini kita akan mengulas teknik isolasi DNA plasmid dari sel bakteri. Biasanya teknik ini menjadi bagian tidak terpisahkan dalam teknik kloning gen yang melibatkan plasmid sebagai wahana (vektor) nya. Namun bisa juga digunakan dengan maksud mengambil plasmid yang mungkin terdapat pada sel bakteri. Gambar di bawah ini menunjukkan DNA plasmid (2) dan DNA kromosom (1) pada sel bakteri.

http://en.wikipedia.org/wiki/plasmid

Prosedur umum yang sering digunakan untuk mengisolasi plasmid dari sel bakteri bisa dilihat di buku Molecular Cloning karya Sambrook dan Russel (2001). Dalam buku tersebut metode isolasinya dibagi berdasarkan jumlah sample sel bakteri yang akan dilisis. Jika kuantitasnya kecil 3-5 ml, maka metode isolasi umum yang digunakan adalah lisis bakteri dengan alkali skala kecil (mini preparation.).

Tahapannya sebagai berikut:

1. Inokulasi koloni tunggal sel bakteri ke dalam 3-5 ml medium Luria Bertani (LB) cair yang mengandung antibiotik tertentu (disesuaikan dengan gen resistensi antibiotik pada plasmid). Inkubasi biakan bakteri selama semalam pada 37 ºC dengan penggoyangan 200 rpm. 
2. Ke dalam tabung mikro sentrifus1,5 ml dimasukkan biakan bakteri semalam. Sentrifugasi 13.000 rpm selama 2 menit. 
3. Supernatan dibuang, pelet yang diperoleh disuspensikan dengan 200 µL Lysing Solution I dingin. Suspensi divorteks selama beberapa saat sampai semua pelet terbilas rata oleh Lysing Solution I. Suspensi diinkubasi dalam es 5 menit.
4. Ke dalam suspensi bakteri, ditambahkan 300 µL Lysing Solution II (larutan selalu dibuat baru). Homogenkan dengan dibolak-balik (tidak divorteks). Suspensi kembali diinkubasi dalam es 5 menit.
5. Ke dalam suspensi bakteri, ditambahan 200 µL Lysing Solution III dingin. Homogenkan kembali dengan dibolak-balik beberapa kali. Suspensi diinkubasi dalam es 5 menit.
6. Suspensi disentrifugasi 13.000 rpm, 2 menit.
7. Supernatan yang diperoleh dipindahkan ke tabung mikro sentrifus 1,5 ml baru. Ke dalam supernatan ditambahkan 400 µL campuran kloroform : isoamil alkohol (24:1). Suspensi divorteks beberapa saat. 
8. Suspensi disentrifugasi 13.000 rpm, 5 menit. Cairan lapisan atas dipindahkan ke tabung mikro sentrifus1,5 ml baru. Penambahan campuran kloroform : isoamil alkohol (24:1) dapat dilakukan beberapa kali untuk meminimalisir adanya kontaminasi pada DNA plasmid yang akan diisolasi.
9. Ke dalam supernatan ditambahkan etanol absolut (96%) sebanyak 2 x volume. Proses ini dilakukan di suhu ruang. Inkubasi supernatan pada suhu ruang selama 10-30 menit. 
10. Larutan disentrifugasi 13.000 rpm, 5 menit. Supernatan dibuang, sedangkan pelet DNA-nya dicuci dengan penambahan 1 ml alkohol 70%. Larutan dibolak-balik beberapa kali. 
11. Larutan kembali disentrifugasi 13.000 rpm. 5 menit. Supernatan dibuang, pelet yang diperoleh dikering-anginkan selama 7-10 menit di suhu ruang. 
12. Pelet DNA plasmid dilarutkan 50 µL buffer TE atau ddH2O yang mengandung enzim RNase 20 µg/ml.
13. Sample siap untuk dilakukan tahap kuantifikasi dengan spektrofotometer atau disimpan dalam pendingin -20 ºC   

Keterangan:

• Lysing Solution I   : 2,5 ml glukosa 2 M, 2 ml EDTA 0,5 M, 2,5 ml Tris 1 M, dan 3 ml ddH2O
• Lysing Solution II  : NaOH 200 mM, SDS 1%
• Lysing Solution III : 60 ml kalium asetat 5 M (pH 4,8), 11,5 ml asam asetat glasial, dan ddH2O sampai volume total 100 ml
• Buffer TE               : Tris pH 8,0 dengan HCl, EDTA 1 mM.
• Medium LB cair (1 liter) : 5 g yeast extract, 10 g tryptone (or peptone), 10 g NaCl.