Vektor Kloning

Membicarakan teknik biologi molekuler (kloning gen), tidak lengkap rasanya jika kita tidak mengulas mengenai vektor kloning. Vektor kloning menjadi penting karena dia berperan sebagai media agar target DNA bisa diperbanyak untuk selanjutnya diekspresi menjadi protein yang diinginkan. Analogi sederhananya adalah ketika kita hendak pergi ke mall yang jaraknya jauh untuk berbelanja, kita tentu memerlukan alat transportasi untuk mencapainya (bisa angkot, motor, mobil pribadi). Seperti alat transportasi inilah peran vektor kloning. Meskipun tidak 100% sama karena alat transportasi akan kita tinggalkan jika kita sudah mencapai mall yang kita tuju, sementara vektor kloning tetap diperlukan, meskipun target DNA kita sudah masuk ke dalam sel organisme inang yang diinginkan.

Ada sangat banyak vektor kloning yang tersedia saat ini, seperti plasmid, cosmid, yeast artificial chromosomes (YACs), bacterial artificial chromosomes (BACs), phage, transposon, dll. Vektor kloning yang kita gunakan setidaknya harus memenuhi beberapa persyaratan:

1. Mengandung replicon yang memungkinkan vektor kloning mereplikasi (mencopy) dirinya sendiri saat di dalam sel inang.
2. Ukurannya cukup kecil dan tidak terdegradasi selama pemurnian
3. Mengandung gen penanda selektif (selectable marker) yang berperan dalam tahap penyeleksian sel inang apakah telah mengandung vektor rekombinan atau tidak. 
4. Memiliki daerah pemutusan yang unik (multi cloning site) sehingga memungkinkan vektor rekombinan dipotong secara enzimatis sehingga target DNA dapat diperoleh kembali. 
5. Beberapa vektor yang diperlukan untuk tahap ekspresi gen menjadi protein harus mengandung sekuen promoter, terminator, dan ribosome binding sites.

Plasmid

Merupakan vektor kloning yang paling banyak digunakan untuk inang sel bakteri. Umumnya berukuran <5 kb, berbentuk DNA sirkular utas ganda, yang biasanya secara alami ada di sel bakteri. Plasmid mengandung kemampuan memperbanyak dirinya sendiri (syaratnya harus berada di dalam sel inang bakteri) dari mulai 1 copy per sel, 10-20 copy per sel sampai 1000 copy per sel. Kemampuan memperbanyak dirinya sendiri ini karena plasmid memiliki titik replikasi (origin of replication). Plasmid juga memiliki multi cloning site (MCS), yaitu daerah yang dikenali enzim restriksi endonuklease, yang memungkinkan plasmid disambung dengan target DNA. 

Disamping memiliki kelebihan, vektor kloning plasmid memiliki beberapa kekurangan, seperti ukuran target DNA yang bisa disisipkan terbatas (sekitar 10 kb), untuk target DNA yang ukurannya besar seringkali sulit ditangani dan mudah terdegradasi, kemampuan untuk masuk ke sel inang bakteri (transformasi) semakin menurun dengan semakin besarnya ukuran plasmid. Gambar di bawah ini adalah salah satu contoh vektor kloning plasmid yang pernah saya gunakan:

Gambar salah satu plasmid yang digunakan dalam teknik kloning (sumber: Promega)

Bersambung....

Sintesis Molekul Rekombinan

Sintesis molekul rekombinan (gabungan dari dua sumber DNA berbeda) merupakan tahapan penting dalam teknik kloning gen. Ada dua tahapan dalam konstruksi suatu molekul rekombinan, yaitu tahap pemotongan fragmen DNA target (yang hendak kita perbanyak) dan DNA vektor kloning (misalnya plasmid) dan tahap penyambungan (ligasi) DNA target ke dalam vektor kloning.

Teknik pemotongan fragmen DNA bukan perkara yang mudah. Teknik ini melibatkan kerja dari suatu enzim yang dikenal dengan enzim restriksi endonuklease. Enzim ini memotong secara spesifik fragment DNA dengan urutan basa tertentu. Daerah yang dipotong enzim ini dikenal dengan daerah restriksi. Enzim ini bekerja memutus ikatan fosfodiester dari di antara dua basa dalam fragment DNA. Sebagai contoh enzim restriksi endonuklease EcoRI akan memutus fragmen DNA yang memiliki urutan basa DNA: GAATTC. Enzim ini akan memutus ikatan fosfodiester di antara basa G dan A (lihat gambar).

Biasanya dalam teknik pemotongan terget DNA maupun DNA vektor kloning digunakan dua macam enzim restriksi endonuklease tipe II yang berbeda daerah pemutusannya. Saya pernah menggunakan enzim EcoRI dan BamHI secara bersamaan untuk memotong target DNA dan vektor kloning yang saya pakai. Tahapan pemilihan dua enzim yang berbeda ini menjadi penting agar di dalam tahapan selanjutnya (tahap penyambungan kedua fragmen DNA) tidak terjadi kesalahan (urutan fragmen target DNA terbalik menyambung di DNA vektor kloning).

Sebagai tips, gunakan enzim restriksi yang menghasilkan ujung pemotongan lengket (sticky end) seperti pada enzim EcoRI, bukan ujung tumpul (blunt end). Ujung lengket akan lebih memudahkan kita dalam menyambungankan dua fragmen DNA ini.

Setelah dua enzim terpotong dengan baik, tahap selanjutnya adalah penyambungan dua fragmen DNA yang sudah terpotong dengan bantuan enzim ligase. Enzim ligase bekerja mengkatalisis pembentukkan ikatan fosfodiester di antara ujung 3' hidroksil dan ujung 5' fosfat pada fragmen DNA yang hendak disambungkan. Skema pemotongan sekaligus penyambungan kedua fragmen DNA dilukiskan dalam gambar di bawah ini:

Tahapan Konstruksi Mokelul Rekombinan

Dalam teknik kloning gen, kedua tahapan ini menjadi penting karena menjadi teknik yang sangat menentukan apakah target DNA kita bisa diklon (diperbanyak) atau tidak nantinya. Jika tahap konstruksi molekul rekombinan ini gagal, maka gagal pula tahapan selanjutnya.

Polymerase Chain Reaction

Polymerase Chain Reaction merupakan metode yang umum digunakan dalam teknik biologi molekuler. Teknik ini bertujuan untuk mengamplifikasi (memperbanyak) sekuen asam nukleat menggunakan polimerisasi berulang dari sekuen DNA. Teknik ini pertama kali diperkenalkan oleh Kary B. Mullis pada pertengahan 1985.

Tahapan PCR

Kebutuhan penting bagi berlangsungnya proses amplifikasi dengan teknik PCR adalah

1. Tersedianya dua primer oligonukleotida sintetik (panjangnya sekitar 20 nukleotida) yang susunan basanya komplemen (berpasangan) dengan utas DNA cetakan (target amplifikasi)
2. Sekuen target yang akan diamplifikasi (panjangnga sekitar 100-5000 pasang basa)
3. Enzim DNA polimerase termostabil yang tahan sampai suhu tinggi (misalnya 95 derajat celcius)
4. Empat molekul deoksiribinukleotida (bahan penyusun utas DNA yang akan dibuat)

(Sumber: Glick & Pasternak, 1994)

Proses PCR memerlukan sejumlah siklus untuk mengamplifikasi suatu sekuen DNA spesifik. Setiap  siklus terdiri atas tiga tahap berkelanjutan, yaitu denaturasi, annealing (hibridisasi), dan ekstensi (polimerisasi) - lihat gambar.

Pada tahap denaturasi, contoh DNA didenaturasi termal  dengan mengatur suhu sampai 95^oC. Proses ini menyebabkan DNA utas ganda menjadi DNA utas tunggal. 

Pada tahap annealing, suhu campuran secara lambat didinginkan sampai mencapai ~55^oC atau sesuai melting temperature (Tm) dari oligonukleotida primer. Selama tahap ini, basa primer berpasangan dengan sekuen komplementernya di dalam DNA sumber (target). Oligonukleotida primer melekat pada masing-masing utas tunggal DNA dengan arah yang berlawanan (satu primer melekat pada ujung utas DNA yang satu sedangkan primer yang lain melekat pada ujung utas DNA komplementernya). 

Pada tahap ekstensi, suhu dinaikkan menjadi ~72^oC. Selama tahap ini, enzim Taq DNA Polymerase mengkatalisis reaksi penambahan mononukleotida pada primer yang sesuai dengan utas DNA komplemen yang berada di sebelahnya. Suhu pada setiap tahap diatur sedemikian rupa sehingga dihasilkan amplifikasi sekuen target DNA yang efisien (Saiki et al. 1989). 


Catatan:

• Melting temperature : suhu yang diperlukan untuk membuat DNA utas ganda menjadi DNA utas tunggal.
• Contoh sekuen primer yang komplemen terhadap DNA sumber (target)

http://www.ars.usda.gov 

Isolasi DNA Kromosom

http://ehrig-privat.de/ueg/images/dna-structure.jpg

Isolasi DNA merupakan metode awal dalam teknik kloning gen. DNA yang mengandung gen target terlebih dahulu diisolasi (diekstraksi) dari sel asal (bisa sel bakteri, tanaman, hewan, atau manusia). Protokol yang ideal  untuk isolasi adalah mudah, murah, dan cocok diaplikasikan untuk sample dalam jumlah kecil.

Isolasi DNA yang paling mudah menggunakan detergen, garam, dan alkohol. Detergen berguna untuk merusak struktur sel, garam dapat terikat pada DNA, dan alkohol (etanol) digunakan untuk mengendapkan DNA, selain untuk membersihkan DNA dari sisa-sisa komponen sel yang lain.

Prinsip Isolasi DNA

• Preparasi sel sumber
• Sel dilisis dengan SDS (sodium dodecyl sulfate), DTT, atau Proteinase K
• Pelisisan membran sel/organel/nukleus menggunakan:
• Fenol : Kuat melisis mebran sel, tetapi toksik
• Guanidine isothiosianate : Tidak toksik, digunakan sebagai pengganti fenol
• Denaturasi senyawa organik dalam sel dengan:
• Kloroform : Prosedur sederhana dan murah
• Proteinase K : Untuk mendenaturasi protein, perlu inkubasi
• Presipitasi (pengendapan) DNA dengan penambahan:
• Isopropanol
• Etanol absolut dan sodium asetat dengan perbandingan 1:1
• Pencucian atau Purifikasi DNA menggunakan:
• Etanol 70%

Isolasi DNA Sel Eukariot Protozoa dengan Metode Chelex (Chelating Ion Exchange) Resin

1. Disiapkan larutan 5-20% Chelex di dalam 1X buffer Tris-EDTA (simpan segera di 4ºC jika tidak digunakan). 
2. Persiapan sample:
• Sample sel ditambahkan 1 ml saponin/PBS 0,5% dingin dan diinkubasi semalam pada 4ºC.
• Sample disentrifugasi 12.000 rpm, 10 menit untuk mendapatkan peletnya.
• Pelet dicuci dengan 1 ml PBS pH 7.2 dan disentrifus lagi pada 4000 rpm, 5 menit (3x).
• Pelet ditambahkan 50 µL dH₂O steril dan 200 µL suspensi Chelex 20%.
• Suspensi diinkubasi dalam penangas air mendidih selama 8 menit dengan sesekali divorteks setiap 3 menit.
• Suspensi disentrifugasi 12.000 rpm selama 10 menit untuk mendapatkan supernatanya.
• Supernatan yang diperoleh dipindahkan ke tabung baru dan disimpan pada -20^oC. DNA hasil isolasi siap digunakan untuk tahap selanjutnya.

Isolasi DNA dari Sel Tanaman dengan Metode CTAB

1. Sterilisasi semua alat yang akan digunakan (mortar, )menggunakan autoklaf suhu 121ºC, tekanan 15 psi, selama 30 menit.
2. Siapkan sample tanaman misalnya daun yang masih muda berusia sekitar 3 minggu.
3. Daun dicacah menggunakan gunting dan dimasukkan dalam mortar.
4. Tambahkan nitrogen cair secukupnya dan gerus daun hingga halus. Lakukan pengulangan beberapa kali sampai daun benar-benar halus.
5. Daun yang sudah halus ditambahkan 500 µL buffer CTAB (kandungannya: CTAB 10 ml, PVP 0,4 g, dan betha merkapto etanol 50 µL).
6. Larutan sample dimasukkan dalam tabung sentrifus mikro steril 1,5 ml.
7. Sample diinkubasi dalam waterbath suhu 65ºC selama 60 menit (setiap 10 menit, sample dibolak-balik agar homogen).
8. Ke dalam sample ditambahkan 500 µL campuran kloroform : isoamil alkohol (24:1). Sample dihomogenkan dengan dibolak-balik selama beberapa kali.
9. Sample disentrifugasi pada 14.000 rpm selama 7 menit.
10. Lapisan paling atas dipindahkan ke tabung mikrosentrifus steril baru. Untuk meminimalisir pengotor pada DNA yang akan disolasi, penambahan campuran kloroform : isoamil alkohol (24:1) bisa dilakukan beberapa kali. 
11. Ke dalam larutan sample ditambahkan amonium asetat dingin sebanyak 0,08 x volume dan isopropanol dingin sebanyak 0,54 x volume. Tahapan ini berguna untuk mengendapkan DNA target.
12. Larutan diinkubasi dalam es selama 30 menit. Tahap ini juga berguna untuk membantu percepatan pengendapan DNA target.
13. Sample disentrifugasi 15 menit pada 14.000 rpm.
14. Supernatan dibuang, sementara pelet DNA yang diperoleh ditambahkan 700 µL alkohol 70%. Sample dibolak-balik beberapa kali agar semua bagian DNA terbilas alkohol.
15. Sample kembali disentrifugasi pada 14.000 rpm selama 1 menit.
16. Supernatan dibuang, pelet yang diperoleh ditambahkan 700 µL alkohol 95%. Sample dibolak-balik beberapa kali. 
17. Sample disentrifugasi selama 1 menit pada 14.000 rpm. Supernatan dibuang, sementara pelet DNA yang diperoleh dikering-anginkan 15 menit. 
18. Setelah kering, pelet DNA disuspensikan dengan penambahan 50 µL buffer TE.
19. DNA siap digunakan untuk analisis selanjutnya seperti kuantitasi DNA dengan spektrofotometer atau disimpan pada -20ºC.

Catatan:

• Isolasi DNA target dari sel tumbuhan lebih sulit karena pada tumbuhan banyak menghasilkan metabolit sekunder yang disimpan di vakuola. Sementara vakuola sendiri ukurannya relatif besar.
• Jika pada tahapan isolasi DNA target, vakuola pecah, maka sudah bisa dipastikan metabolit sekunder dalam vakuola akan menjadi penggangu atau kontaminan. 

Kloning Gen

Perkembangan bioteknologi semakin menarik ketika era rekayasa genetika datang di tahun 70-an. Saat itu mulai dipublikasikannya teknik rekombinan DNA oleh Stanley Cohen dari Stanford University dan Herbert Boyer dari University of California. Dengan teknik ini kita dimungkinkan memproduksi protein di dalam sel yang dikultur. Orang menyebut era ini dengan era bioteknologi modern.

Dalam teknik rekombinan DNA, satu DNA yang menjadi target (misalnya DNA yang mengandung gen Insulin untuk memproduksi protein insulin yang penting untuk terapi penyakit diabetes) disambungkan dengan DNA lain yang menyebabkan DNA target bisa digandakan dalam jumlah yang besar. DNA lain yang disambungkan dengan DNA target ini kita kenal dengan cloning vector (contohnya plasmid, cosmid, Bacterial Artificial Chromosomes, Yeast Artificial Chromosomes, dll).

Ketika DNA target berhasil disambungkan (melalui teknik enzimatis) dengan DNA Cloning Vector (misalnya plasmid), maka terlahirlah DNA rekombinan. DNA rekombinan ini yang nantinya akan kita perbanyak dengan teknik kloning gen (bukan teknik kloning untuk menghasilkan individu baru looh, seperti kasus domba dolly!).

Berikut sedikit saya perlihatkan skema teknik kloning gen untuk menghasilkan atau memperbanyak (klon) DNA target kita (diambil dari riset tesis S2 saya).

Melihat skema di atas, untuk memperbanyak DNA terget melalui teknik kloning butuh tahapan yang tidak sedikit, dari mulai isolasi DNA target, lalu perbanyakannya melalui teknik PCR (polymerase chain reaction), pemurnian DNA target, penyambungan DNA target dengan DNA vector cloning (saya menggunakan plasmid pCR 2.1-TOPO) sehingga menghasilkan vector rekombinan, teknik pentransferan vector rekombinan ke inang tertentu (dalam hal in dipilih bakteri Escherichia coli TOP10) untuk perbanyakan, sampai teknik sekuensing untuk melihat urutan DNA target yang sudah diperbanyak apakah masih benar atau tidak.

Insya Alloh teknik-teknik ini akan dibahas lebih detail pada kesempatan yang akan datang.

Mengenal Bioteknologi

Menurut United Nation Convention on Biological Diversity, bioteknologi adalah aplikasi teknologi yang menggunakan sistem biologi, organisme hidup, atau turunannya untuk membuat, mengembangkan, atau memodifikasi suatu produk atau proses untuk tujuan khusus tertentu.

Aplikasi Bioteknologi

Bioteknologi bukan ilmu kemarin sore. Sudah sejak ribuan tahun yang lalu peran bioteknologi bagi kehidupan manusia telah dirasakan, bahkan sampai kini, dan di masa yang akan datang. Bahkan sebagian orang meyakini, bioteknologi akan menjadi bidang ilmu masa depan yang paling berperan dalam kehidupan umat manusia. Semua bidang kehidupan manusia bisa merasakan tangan dingin ilmu bioteknologi seperti bidang pertanian, peternakan, kedokteran, dan lain sebagainya.

Semua ini tidak terlepas dari keterkaitan erat bioteknologi dengan ilmu-ilmu biologi murni seperti genetik, mikrobiologi, kultur sel hewan, biologi molekuler, biokimia, embriologi, dan biologi sel. Ilmu-ilmu ini yang menjadi dasar berkembang pesatnya bioteknologi. Apalagi dengan tambahan dukungan dari pengetahuan dan metode-metode yang berkembang di bidang teknik kimia, teknik bioproses, bioinformatik, dan biorobotik. 

Sejarah Bioteknologi

Selama ribuan tahun, manusia telah menggunakan pembiakan selektif untuk meningkatkan produksi tanaman dan ternak untuk kebutuhan hidup manusia. Dalam pemuliaan selektif, organisme dengan karakteristik yang diinginkan dikawinkan untuk menghasilkan keturunan dengan karakteristik yang sama. Teknik ini misalnya digunakan untuk menyeleksi bibit jagung yang menghasilkan hasil panen yang tinggi dan memiliki rasa termanis. Inilah awal perkembangan bioteknologi tradisional.

Bioteknologi juga dimanfaatkan dalam bidang fermentasi bir di Mesopotamia, Mesir, dan India. Dalam pembuatan bir, pati dari biji-bijian dikonversi oleh enzim menjadi gula. Lalu dengan tambahan ragi, gula tersebut dikonversi menjadi bir. Dalam proses ini, karbohidrat dalam biji-bijian yang dipecah menjadi alkohol seperti etanol. 

Bioteknologi juga digunakan dalam pengembangan antibiotika. Tahun 1928, Alexander Fleming menemukan jamur yang dapat menghasilkan penisilin sebagai obat untuk infeksi bakteri pada manusia.

Tahun 70-an, perkembangan bioteknologi semakin menarik. Inilah awal dimulainya era bioteknologi modern. Di tahun 1972, ditemukannya teknologi baru dalam transfer materi genetik ke dalam bakteri oleh Herbert W. Boyer dari Universitas California dan Stanley N. Cohen dari Universitas Stanford. Teknologi ini memungkinkan kita memperbanyak material genetik di bakteri, yang nantinya bisa diarahkan untuk menghasilkan protein tertentu misalnya hormon insulin untuk terapi penyakit diabetes.

Sekapur Sirih

Blog GoBiotech berisi informasi seputar bidang ilmu bioteknologi, baik berupa teori dasar maupun terapan, didukung dengan hasil perkembangan terbaru penelitian bioteknologi di Indonesia dan mancanegara.

Kehadiran blog GoBiotech mudah-mudahan mampu memberikan kontribusi positif bagi perkembangan bioteknologi di Indonesia, terutama untuk kalangan mahasiswa yang sedang mendalami bidang ilmu masa depan ini.

Karena menyadari segala keterbatasan ilmu yang dimiliki, kontributor blog GoBiotech dengan tangan terbuka dan senang hati menerima segala kritik dan saran dari semua pengunjung. Begitu pula jika para pengunjung berkenan memberikan kontribusi aktifnya. 

Salam hangat!

Sapto Nugroho Hadi