Isolasi DNA Plasmid dari Sel Bakteri

Setelah sebelumnya kita mempelajari teknik isolasi DNA kromosom, kali ini kita akan mengulas teknik isolasi DNA plasmid dari sel bakteri. Biasanya teknik ini menjadi bagian tidak terpisahkan dalam teknik kloning gen yang melibatkan plasmid sebagai wahana (vektor) nya. Namun bisa juga digunakan dengan maksud mengambil plasmid yang mungkin terdapat pada sel bakteri. Gambar di bawah ini menunjukkan DNA plasmid (2) dan DNA kromosom (1) pada sel bakteri.

http://en.wikipedia.org/wiki/plasmid

Prosedur umum yang sering digunakan untuk mengisolasi plasmid dari sel bakteri bisa dilihat di buku Molecular Cloning karya Sambrook dan Russel (2001). Dalam buku tersebut metode isolasinya dibagi berdasarkan jumlah sample sel bakteri yang akan dilisis. Jika kuantitasnya kecil 3-5 ml, maka metode isolasi umum yang digunakan adalah lisis bakteri dengan alkali skala kecil (mini preparation.).

Tahapannya sebagai berikut:

1. Inokulasi koloni tunggal sel bakteri ke dalam 3-5 ml medium Luria Bertani (LB) cair yang mengandung antibiotik tertentu (disesuaikan dengan gen resistensi antibiotik pada plasmid). Inkubasi biakan bakteri selama semalam pada 37 ºC dengan penggoyangan 200 rpm. 
2. Ke dalam tabung mikro sentrifus1,5 ml dimasukkan biakan bakteri semalam. Sentrifugasi 13.000 rpm selama 2 menit. 
3. Supernatan dibuang, pelet yang diperoleh disuspensikan dengan 200 µL Lysing Solution I dingin. Suspensi divorteks selama beberapa saat sampai semua pelet terbilas rata oleh Lysing Solution I. Suspensi diinkubasi dalam es 5 menit.
4. Ke dalam suspensi bakteri, ditambahkan 300 µL Lysing Solution II (larutan selalu dibuat baru). Homogenkan dengan dibolak-balik (tidak divorteks). Suspensi kembali diinkubasi dalam es 5 menit.
5. Ke dalam suspensi bakteri, ditambahan 200 µL Lysing Solution III dingin. Homogenkan kembali dengan dibolak-balik beberapa kali. Suspensi diinkubasi dalam es 5 menit.
6. Suspensi disentrifugasi 13.000 rpm, 2 menit.
7. Supernatan yang diperoleh dipindahkan ke tabung mikro sentrifus 1,5 ml baru. Ke dalam supernatan ditambahkan 400 µL campuran kloroform : isoamil alkohol (24:1). Suspensi divorteks beberapa saat. 
8. Suspensi disentrifugasi 13.000 rpm, 5 menit. Cairan lapisan atas dipindahkan ke tabung mikro sentrifus1,5 ml baru. Penambahan campuran kloroform : isoamil alkohol (24:1) dapat dilakukan beberapa kali untuk meminimalisir adanya kontaminasi pada DNA plasmid yang akan diisolasi.
9. Ke dalam supernatan ditambahkan etanol absolut (96%) sebanyak 2 x volume. Proses ini dilakukan di suhu ruang. Inkubasi supernatan pada suhu ruang selama 10-30 menit. 
10. Larutan disentrifugasi 13.000 rpm, 5 menit. Supernatan dibuang, sedangkan pelet DNA-nya dicuci dengan penambahan 1 ml alkohol 70%. Larutan dibolak-balik beberapa kali. 
11. Larutan kembali disentrifugasi 13.000 rpm. 5 menit. Supernatan dibuang, pelet yang diperoleh dikering-anginkan selama 7-10 menit di suhu ruang. 
12. Pelet DNA plasmid dilarutkan 50 µL buffer TE atau ddH2O yang mengandung enzim RNase 20 µg/ml.
13. Sample siap untuk dilakukan tahap kuantifikasi dengan spektrofotometer atau disimpan dalam pendingin -20 ºC   

Keterangan:

• Lysing Solution I   : 2,5 ml glukosa 2 M, 2 ml EDTA 0,5 M, 2,5 ml Tris 1 M, dan 3 ml ddH2O
• Lysing Solution II  : NaOH 200 mM, SDS 1%
• Lysing Solution III : 60 ml kalium asetat 5 M (pH 4,8), 11,5 ml asam asetat glasial, dan ddH2O sampai volume total 100 ml
• Buffer TE               : Tris pH 8,0 dengan HCl, EDTA 1 mM.
• Medium LB cair (1 liter) : 5 g yeast extract, 10 g tryptone (or peptone), 10 g NaCl. 

Bioteknologi Yang Lebih Membumi!

Senin sampai rabu, 10-12 Juni 2013 kemarin, Laboratorium Pemuliaan Tanaman dan Bioteknologi, Universitas Jenderal Soedirman mengadakan acara pelatihan Teknik-Teknik Dasar Bioteknologi. Acara yang dikemas cukup apik dengan mengedepankan aspek pengenalan dan pembekalan kemampuan teknis buat para pesertanya (bukan hanya sekedar teori belaka) ini cukup menarik minat masyarakat. Terbukti dengan jumlah peserta yang mencapai 22 orang (dari 23 orang pendaftar) melebihi target yang hanya 20 orang. Jumlah peserta memang sengaja dibatasi agar acara pelatihan teknis yang diadakan lebih optimal.

Dengan biaya 500 ribu untuk tiga hari pelatihan, beragam kemampuan teknis diajarkan kepada peserta, dari mulai pemipetan, hitungan kimia, sampai kepada teknik isolasi DNA dan kuantitasinya, Polymerase Chain Reaction, dan pemotongan DNA dengan enzim restriksi. Peserta juga tidak lupa dibekali praktik dry lab seperti desain primer, pembuatan marka molekul, dan analisis kekerabatan dengan pohon filogenetik.

Para instruktur, yang terdiri atas dosen dan peneliti di lingkungan Fakultas Pertanian UNSOED (Suprayogi, Ph.D, Dr. Noor Farid, Prita Sari Dewi, Ph.D, Dyah Susanti, MP., dan Sapto Nugroho Hadi, M.Biotech) dan mitranya dari PT NUTRILAB PRATAMA (Dasep, SSi dan Yoyon Arif, SSi), dibantu staf dan mahasiswa di lingkungan Laboratorium Pemuliaan Tanaman dan Bioteknologi (Eko Binnaryo Mei Adi, MP., Priyatiningsih, SP, dan Amri Susetiyo) selain mengajarkan dan melatih peserta tentang teknik-teknik dasar bioteknologi dengan prosedur dan alat konvensional, juga memberikan pelatihan bagaimana menggunakan prosedur yang praktis menggunakan kit dan alat-alat mutakhir. Tujuannya agar peserta dapat membandingkan kedua teknik tersebut dan bisa memilih teknik dan alat mana yang akan digunakan di tempat masing-masing, tentu disesuaikan dengan kemampuan instansinya.

Dari hasil yang diperoleh, terungkap bahwa teknik konvensional ternyata mampu menghasilkan data yang kurang lebih serupa dengan data yang diperoleh dari teknik bioteknologi yang menggunakan kit dan alat lebih modern. Namun tentu dari segi kepraktisan dan rentang waktu pengerjaan, teknik modern jauh lebih unggul.

Berdasarkan informasi yang diperoleh dari peserta, teknik dasar seperti ini sudah seharusnya sering diberikan kepada masyarakat umum agar lebih membumi. Bagi sebagian peserta ilmu bioteknologi bagaikan ilmu khayalan dan imajinatif. Mereka mengetahui tentang bioteknologi hanya sebatas dari buku ajar ataupun informasi yang mereka dapat dari media. Wajar saja ketika teknik bioteknologi ini diajarkan kepada mereka, rasa takjub bahwa ternyata DNA bisa diisolasi, dikuantitasi, dideteksi, bahkan dipotong menjadi pengalaman yang luar biasa dan bisa menjadi oleh-oleh yang berharga bagi murid, mahasiswa, atau rekan-rekan di instansi masing-masing. Sebagian peserta berharap acara pelatihan ini ada kelanjutannya agar kemampuan dan keterampilan mereka semakin terasah.

Semoga ke depannya, ilmu bioteknologi dan aplikasinya bisa lebih membumi dan dirasakan manfaatnya oleh masyarakat dalam lingkup lebih luas.