Polymerase Chain Reaction

Polymerase Chain Reaction merupakan metode yang umum digunakan dalam teknik biologi molekuler. Teknik ini bertujuan untuk mengamplifikasi (memperbanyak) sekuen asam nukleat menggunakan polimerisasi berulang dari sekuen DNA. Teknik ini pertama kali diperkenalkan oleh Kary B. Mullis pada pertengahan 1985.

Tahapan PCR

Kebutuhan penting bagi berlangsungnya proses amplifikasi dengan teknik PCR adalah

1. Tersedianya dua primer oligonukleotida sintetik (panjangnya sekitar 20 nukleotida) yang susunan basanya komplemen (berpasangan) dengan utas DNA cetakan (target amplifikasi)
2. Sekuen target yang akan diamplifikasi (panjangnga sekitar 100-5000 pasang basa)
3. Enzim DNA polimerase termostabil yang tahan sampai suhu tinggi (misalnya 95 derajat celcius)
4. Empat molekul deoksiribinukleotida (bahan penyusun utas DNA yang akan dibuat)

(Sumber: Glick & Pasternak, 1994)

Proses PCR memerlukan sejumlah siklus untuk mengamplifikasi suatu sekuen DNA spesifik. Setiap  siklus terdiri atas tiga tahap berkelanjutan, yaitu denaturasi, annealing (hibridisasi), dan ekstensi (polimerisasi) - lihat gambar.

Pada tahap denaturasi, contoh DNA didenaturasi termal  dengan mengatur suhu sampai 95^oC. Proses ini menyebabkan DNA utas ganda menjadi DNA utas tunggal. 

Pada tahap annealing, suhu campuran secara lambat didinginkan sampai mencapai ~55^oC atau sesuai melting temperature (Tm) dari oligonukleotida primer. Selama tahap ini, basa primer berpasangan dengan sekuen komplementernya di dalam DNA sumber (target). Oligonukleotida primer melekat pada masing-masing utas tunggal DNA dengan arah yang berlawanan (satu primer melekat pada ujung utas DNA yang satu sedangkan primer yang lain melekat pada ujung utas DNA komplementernya). 

Pada tahap ekstensi, suhu dinaikkan menjadi ~72^oC. Selama tahap ini, enzim Taq DNA Polymerase mengkatalisis reaksi penambahan mononukleotida pada primer yang sesuai dengan utas DNA komplemen yang berada di sebelahnya. Suhu pada setiap tahap diatur sedemikian rupa sehingga dihasilkan amplifikasi sekuen target DNA yang efisien (Saiki et al. 1989). 


Catatan:

• Melting temperature : suhu yang diperlukan untuk membuat DNA utas ganda menjadi DNA utas tunggal.
• Contoh sekuen primer yang komplemen terhadap DNA sumber (target)

http://www.ars.usda.gov