Pemilihan Primer PCR yang Tepat

Dalam teknik Polymerase Chain Reaction (PCR) atau sintesis DNA secara in vitro (di tabung) menggunakan alat thermal cycler, terdapat komponen penting yang harus ada untuk berlangsungnya reaksi sintesis. Komponen tersebut adalah PRIMER.

Primer merupakan sekuen DNA berukuran pendek antara 17-28 nukleotida (bisa juga memiliki panjang <17atau >28), yang berperan dalam mengawali proses sintesis DNA yang dikatalisis oleh enzim DNA polimerase. Peran primer pada sintesis DNA secara in vitro melalui teknik PCR serupa dengan tugas primer pada proses sintesis DNA di dalam sel (replikasi DNA). Sekuen oligonukleotida primer menjadi sangat vital karena enzim DNA polimerase, tidak mampu mengawali proses sintesis utas DNA baru tanpa adanya primer.

Untuk mendapatkan produk sintesis DNA yang benar dan tepat, maka sekuen primer yang digunakan harus benar-benar dipilih dengan tepat. Pemilihan primer akan mempengaruhi kualitas produk PCR. Berikut ini beberapa peraturan umum dalam memilih suatu primer yang baik (Sumber: Rychlik,1993; bioweb.uwlax.edu):

• Primer tidak membentuk PRIMER-DIMER (antar primer saling menempel sendiri karena susunan nukleotidanya komplemen).

Self-dimer (Primer Dimer): bioweb.uwlax.edu

• Primer tidak membentuk SELF-COMPLEMENTARY (di dalam satu primer terdapat susunan nukletida yang komplemen sehingga terbentuk ikatan hidrogen

www.atdbio.com

• Primer tidak terlalu panjang atau pendek. Primer yang terlalu pendek akan memudahkannya menempel di banyak tempat pada DNA cetakan. Primer yang terlalu panjang akan menyulitkannya menempel pada DNA cetakan.Untuk target produk PCR berukuran <500 bp gunakan primer berukuran 16-18 nukleotida. Untuk produk PCR yang panjang gunakan primer dengan panjang 24 nukleotida.
• Gunakan primer yang memiliki susunan nukleotida yang unik. Primer dengan susunan nukleotida AAAAAAA atau AAACCCGGG tidak unik. Primer dengan susunan nukleotida ACGTCGCTAGCGATCGCATGCCAGTC unik.
• Komposisi G+C primer berkisar 40-60%. Beberapa sumber menyebutkan 50-60%. Primer yang memiliki komposisi AT tinggi akan menyebabkan terbentuknya ikatan hidrogen yang lebih lemah dengan DNA cetak.
• Primer memiliki Tm berkisar 55-80 oC.
• Ujung 3' primer seharusnya mengandung basa C atau G untuk memudahkannya menempel atau membentuk ikatan hidrogen yang lebih kuat dengan pasangan basa pada DNA cetakan. 

Seminar Nasional Bioteknologi UGM Tahun 2015

TRANSFORMASI KEJUT-PANAS

Transformasi merupakan salah satu tahap dalam teknik kloning gen. Tujuan dari transformasi adalah mentransfer molekul DNA rekombinan ke dalam sel inang (host). Saya misalkan inang yang digunakan adalah sel bakteri Escherichia coli (umum digunakan dalam teknologi kloning gen).

Sel E.coli yang digunakan bukan sembarang sel. Sel E.coli harus mengalami pengkondisian sehingga siap dijadikan inang untuk proses transformasi. Dalam istilah ilmiahnya, sel E.coli dibuat kompeten terlebih dahulu. Makanya dalam dunia kloning gen dikenal dengan sebutan competent cells. Yang menjadi pertanyaan, bagaimana membuat sel E.coli menjadi transforman??

Sebagian kita membuat pilihan praktis. Tinggal pesan ke vendor tertentu, lalu tinggal pakai. Beberapa yang lainnya lebih memilih mengkondisikan sendiri sel E.coli-nya supaya bisa kompeten dimasuki molekul DNA rekombinan. Lalu bagaimana tekniknya? Salah satunya, sel dibuat kompeten secara kimia atau menambahkan senyawa kimia tertentu seperti adalah CaCl2 (calcium chloride). Muatan Ca2+ dalam CaCl2 akan mengganggu muatan gugus fosfat dari senyawa fosfolipid, penyusun membran sel bakteri. Gangguan ini akan menyebabkan membran sel bakteri lebih mudah dimasuki oleh molekul DNA rekombinan. Prosedur detailnya dapat dilihat di link berikut: making competent cells

Setelah sel kompeten sudah disiapkan, transformasi molekul DNA rekombinan dapat dilakukan. Terdapat beberapa metode transformasi molekul DNA rekombinan ke dalam sel inang E.coli. Teknik yang paling sederhana adalah HEAT-SHOCK METHOD atau METODE KEJUT-PANAS. Intinya molekul DNA rekombinan dan sel E.coli kompeten ditempatkan di tabung yang sama. Campuran didinginkan dalam es 30 menit, dipanaskan dalam air suhu 42oC selama 45 detik, dan didinginkan lagi dalam es selama 5 menit. Semua dilakukan secara cepat. Harapannya saat sel bakteri di panaskan, maka pori-pori sel bakteri akan membuka dan molekul DNA rekombinan dapat masuk ke dalam sel inang E.coli. Pori-pori akan menutup kembali ketika sel E.coli didinginkan. Sel E.coli yang sudah mengandung molekul DNA rekombinan disebut dengan transformant cells. Sel ini selanjutnya ditumbuhkan dalam media tertentu untuk menjalani tahapan kloning selanjutnya.